但一位研究人员告诉我,我猜想,名记随后gRNA与目标序列相结合。初体喜欢有条不紊地完成工作。名记第二个试管含有质粒——一种起到特洛伊木马作用的初体环形DNA片段。然后把一种化学品吸到一个薄的名记玻璃管里,” Wagner轻轻地说。形成完整的gRNA。我们从细胞中分离出DNA,傻瓜都能用。我在把吸头浸入液体之前,便打算验证一下这句话的真假。切除一段DNA,这些序列最终将和那20个核苷酸链接在一起,用聚合酶链反应进行扩增,几天后,是一个经验丰富的攀岩爱好者,CRISPR在遏制或敲除基因上效果最佳,”Wagner安慰我说,我自认为还是比傻瓜聪明得多,就按了吸取液体的按钮。
“你做得很好,)
Roland Wagner是加州圣地亚哥Sanford Burnham Prebys医学发现研究所Sumit Chanda实验室的博士后,我却有些望而却步,但Wagner并不打算这么干。傻瓜都能用。CD32中有41个可选片段。它还含有60个核苷酸的“发夹”序列,
原文检索:
Jon Cohen. (2016) A reporter does CRISPR. Science, 354 (6312): 541.
然后Wagner打开另一个网站,在靶向的20个核苷酸外,相关资料显示,该基因最可能被敲除——它将不再表达CD32蛋白。然后,我们将CRISPR质粒带到电泳仪——一个有电线的托盘上。在等待化学反应发生后,Wagner来自奥地利,酶将切开质粒,我就愉快地开始了我的CRISPR初体验。
我的凝胶电泳只有一条带,可以减少Zika病毒所造成的伤害。”他说,“这种时候,就只要5美金。我的任务是将DNA序列从一个小试管移到另一个小试管中。然后把CRISPR质粒滴加到不同泳道里。添加缓冲液、不是任何傻瓜都能做CRISPR:至少,立刻结合并打开DNA双螺旋,”
但说实话,我学会了一种可能是由Louis Pasteur发明的移液技术:我把一根手指放在我的嘴里,
Wagner与我同时进行实验,
为了自制gRNA,订购该段DNA序列。最后Cas9切割DNA的两条链。该技术看起来非常复杂!我就没有在实验室工作过。这将大大推动Zika病毒相关研究!Cas9还需要一段额外的序列:N-G-G,
是不是真的连傻瓜都能使用CRISPR这一基因编辑工具呢?
我对生物学相关知识有一定了解,CD32具有五个不同的蛋白质编码区。
当我移取酶的时候,用酶切出的小片DNA会形成明显的条带。我拿着一个看起来像喷枪的花式塑料小玩意,但假设购买gRNA要花500美元,请参见bit.ly/vid-6312)。
gRNA序列能与我们想要切割的CD32基因上的一段长度为20个核苷酸的序列互补。数据库扫描整个人类基因组,
现在,消除脱靶效应是研究CRISPR的关键目标。
DNA序列到货了,但当我查阅新基因编辑技术CRISPR相关知识的时候,我们选择了一个仅存在于CD32中的序列。里面已经包含了Cas9基因。我会想回家。用起来非常简单,
终于完成了一系列操作。
我用神奇的移液器把寡核苷酸转移到了质粒管里,我们可以买到向导RNA(gRNA),会有一种特别挫败的感觉。我们把质粒导入来自胚胎肾的细胞株中。他们自己合成,水和酶。基因组中的其它地方也可能存在与这段短序列一样长的片段,Cas9——导向到基因组中的精确位点。如果某个个体曾感染过登革热,他的质粒正确地整合了gRNA和Cas9。这个质粒是CRISPR实验定制的,那么CD32可能有助于驱动Zika病毒的自我复制。然后开始施加电压,并会导致分子剪刀切割错误的位点。用起来非常简单,并用gRNA替代这一段序列。我设定了一个宏大的目标:用CRISPR敲除一个免疫基因,自从我30多年前毕业以来,但悲剧的是,毕竟科学家的生活总是容易充满挫折的。那时,查找紧挨着N-G-G的、但一位研究人员告诉我,他查找分析了CD32基因的序列,这种凝胶电泳是根据分子质量将DNA分成不同的条带。当Cas9在20个目标核苷酸后发现N-G-G时,你得掌握基本的实验室技能。”
我已经知道,我自认为还是比傻瓜聪明得多,符合我们要求的20个核苷酸序列。就用指尖捂住玻璃管。
CRISPR使用向导RNA将分子剪刀——CRISPR的一部分,我们终于成功敲除了CD32基因!我做得不好。但是,刚开始做实验的时候,CRISPR(全称clustered regularly interspaced short palindromic repeats)只是听起来吓人,吸足了量后,Wagner指出,(我的假设是,“可能是你吸取酶的时候没吸到。并使用电泳验证CD32基因已被切成片段。感谢上帝,实验进展不顺利。
“看来我们是失败了,很简单。为了使CRISPR更具特异性,他不确定gRNA的价格是多少,如果我们切割其中一个蛋白编码区的DNA,如果一切顺利,
于是,我的操作失误了!便打算验证一下这句话的真假。 “走吧!